Il dipinto, commissonato dall'imperatore Carlo V, fu eseguito ad Augusta nel 1548. Isabella di Portogallo (1503-1539) sposò l'imperatore Carlo V nel 1526. Morì molto giovane, quando aveva solo 36 anni, e molto prima che Charles V commissionò a Tiziano di dipingere il suo ritratto. Il suo viso pallido sottolinea la sua dolcezza, che è anche visibile nelle dita sottili delle sue mani. L'intero ritratto è incentrato su una superba armonia cromatica del rosso, del bianco e dell'oro. Un affascinante contrasto cromatico è fornito dalle tinte blu e verde del paesaggio, e dagli occhi dell'imperatrice.